膀胱癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌在中国的发病率和死亡率在恶性泌尿系统肿瘤中位居首位。临床上膀胱镜检和活检作为膀胱癌诊断的金标准，灵敏度为90～97%。然而该检查属于有创检查，可导致患者出现感染出血、损伤等并发症，且费用较高，对于微小肿瘤容易漏诊。
对于患者而言，膀胱镜检查痛苦程度较高，患者依从性差，而常规的尿液脱落细胞学检查是一种膀胱癌无创检测方式，虽有较高的特异性，但灵敏度低，尤其对低分级的肿瘤。
因此，亟需一种新型的、有高特异性、高灵敏度的无创无痛诊断技术，来辅助膀胱镜检查，有效降低患者痛苦，提高检测效率。
由大地同年生物开发的cf-SUPER 技术可将膀胱癌检测的灵敏度提高至97.87%，特异性增加到94.34%，cf-SUPER技术已正式发表于Translational Andrology and Urology期刊，文章标题为《A novel cell-free single-molecule unique primer extension resequencing (cf-SUPER) technology for bladder cancer non-invasive detection in urine》(中文译名：《一种新型单分子引物延伸技术在膀胱癌尿液无创检测中的运用》），通讯作者为中南大学湘雅三医院泌尿外科王龙教授，湖南大地同年生物科技有限公司CTO徐根明。
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文中对cf-SUPER技术进行了详细的描述，并证实了该技术结合高通量测序平台以及生物信息学方法可用于分析尿液中cfDNA的点突变，进而实现膀胱癌的无创辅助诊断。基于cf-SUPER的测序技术采用独创的建库方式，单分子标签（unique molecular identifier，UMI）的运用可实现极低频率的突变检测。DNA模板链在酶的作用下被片段化以及末端修复，包含UMI、index序列和5'端通用序列的adapter被连接至DNA片段的5'末端， 随后进行PCR扩增以及Illumina上机测序。UMI在数据矫正过程中极为重要，利用UMI 对聚集的序列进行统计分析及错误修正，创建一致性序列，并对每个UMI的序列数量及比例进行统计，对一致性序列进行过滤，得到最终的校正后的一致性序列，可进一步提高数据信噪比，进而提高检测的灵敏度。
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本研究选用HorizonDx公司的Multiplex I cfDNA 基因集对cf-SUPER进行评估，实验结果发现采用cf-SUPER的建库方法可以准确检测等位基因分数低至0.01%、DNA含量低至1ng的突变。
为了筛选适用于膀胱癌无创早期诊断的尿液点突变panel，本研究采用基于cf-SUPER的测序技术结合生物信息学方法分析了29例膀胱癌患者的肿瘤组织和血尿尿液样本。此外，共计100人血尿患者参与了该研究，包括53例膀胱癌阴性患者和47例膀胱癌阳性患者。尿液样本的保存采用湖南大地同年的尿液样本保存液以及提取和纯化试剂盒（产品名称：样本保存液，备案号：湘长械备20190386号；产品名称：核酸提取或纯化试剂盒，备案号：湘长械备20190385号）。研究结果发现几乎所有组织样本中的点突变都可以从尿液样本中检测到。最终一个包括TERT 、 FGFR3、 TP53等22个基因（470个突变点）在内的Uriprier panel被构建，通过分析COSMIC数据库中膀胱癌患者的数据，发现这22个基因在近80%的患者中都存在。为了评估Uriprier panel的质量，对47例血尿患者的尿液样本进行检测并进行ROC曲线分析，结果显示该panel可以将膀胱癌筛查的灵敏度和特异性分别提高到97.87%和94.34%，AUC可达0.96。
点突变panel的特异性与灵敏度检测
总而言之，cf-SUPER技术适用于血尿患者的无创辅助诊断，通过分析尿液中cfDNA的点突变来判断是否患有膀胱癌，不仅可以减少膀胱镜的使用，减轻患者疼痛以及经济负担，而且还能降低漏诊及误诊率。同时，基于该技术的液态活检方法具有样本易获取、可实现肿瘤基因谱动态监测等优点，可为其它癌种的无创筛查及辅助诊断开辟一条新的思路。
UriPrier®尿路上皮癌尿液DNA基因检测
基于上述技术平台，湖南大地同年生物正式发布了Uriprier膀胱癌尿液DNA检测产品，Uriprier可以从基因突变、甲基化两个维度双管齐下，助力膀胱尿路上皮癌的辅助诊断。与传统的膀胱癌诊疗手段相比，Uriprier具有便捷、无创、准确性高等特性，是膀胱镜等传统诊疗手段的有效补充，其无创、无痛的特性，可以有效解决患者在做膀胱镜检查时依从性差的问题，并规避尿路感染等风险。在膀胱癌的早期筛查、复发监测等场景有着广泛的应用空间。
参考文献
1. Horstmann M, Patschan O, Hennenlotter J, et al. Combinations of urine-based tumour markers in bladder cancer surveillance[J]. Scandinavian journal of urology and nephrology, 2009, 43(6): 461-466.
2. Lin Q, Long W, Genming X, et al. A novel cell-free single-molecule unique primer extension resequencing (cf-SUPER) technology for bladder cancer non-invasive detection in urine[J]. Translational Andrology and Urology, 2020, 9 (3): 1222-1231.
